WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Iконтрольная группа (интактные животные); II опыт 1 (животные получали раствор канцерогена с питьевой водой); III опыт 2 (животные получали раствор канцерогена с питьевой водой, а также проводили инъекции не нагруженных («пустых») липосом); IV опыт 3 (животные получали раствор канцерогена с питьевой водой, а так же проводили инъекции липосом, нагруженных церамидом); V опыт 4 (животные получали раствор канцерогена с питьевой водой, а также проводили инъекции липосом, нагруженных сфингомиелином). Эвтаназию производили, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденные Министерством Здравоохранения России, путем дислокации шейного отдела позвоночника под эфирным наркозом. Для моделирования гепатоцеллюлярного рака животные вместо питьевой воды получали водный раствор 0,02% Nдиэтилнитрозамина (NДЭНА). Материалом исследования служила печень крыс. Животным в опытных группах в хвостовую вену вводили по 0,25 мл на 100 г массы тела эмульсии, содержащей липосомы. Использовали липосомы, нагруженные сфингомиелином или церамидом («Sigma Aldrich», США), либо не нагруженные («пустые»). При каждой инъекции вводили 33 мкг сфингомиелина или церамида в составе липосом на 100 г массы тела животного. При выборе дозы введения используемых препаратов руководствовались литературными данными о гепатотропных эффектах липидов в составе липосом [Cullis P.R., 1996]. Введение липосом осуществляли на 3 и 4 неделе от начала индукции гепатоцеллюлярной карциномы с интервалом в один день (всего 7 инъекций), что соответствовало раннему периоду канцерогенеза [Антониенко С.Г. и др., 1990]. Исследование изучаемых показателей проводили на 2,4,5,8,12 неделю, считая с момента начала введения канцерогена.

На каждом этапе эксперимента было использовано по 6 животных в каждой группе.

На протяжении исследований смертность животных составила 9%.

Содержание сфингомиелина, церамида и сфингозина в печени оценивали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Экстракцию липидов проводили по Folch (1957).

Хроматограммы окрашивали спиртовым раствором 10% фосфорномолибденовой кислоты с последующим сканированием и оценкой фракций с помощью программы «Chrom 3.1» для Windows.

Активность фосфолипазы А2 (ФЛА2) определяли по прибыли лизофосфатидной кислоты методом ТСХ (Brokerhoff H., 1978).

Активность фосфолипазы D (ФЛD) определяли по количеству фосфатидной кислоты методом ТСХ (Вагина О.Н., 1995).

Определение содержания ТБК–активных продуктов в печени осуществляли в реакции с тиобарбитуровой кислотой по методу Yagi K. (1976). Активность каталазы определяли по методу Королюк М.А. (1988).

Регистрацию апоптоза гепатоцитов осуществляли по анализу фрагментации ДНК (Орлов С.Н., 1987).

Фосфатидилхолин для приготовления липосом получали из куринных яичных желтков по методу Е.М. Краснопольского (1999). Липосомы получали по методу Г.Грегориадиса (1983). Липосомы состояли из фосфатидилхолина с добавлением липосомального буфера (145мМ NaCl, 10мМ трис HCl, рН 7.4), содержащего 0, мг/мл церамида или сфингомиелина («Sigma Aldrich», США). В липосомы включалось до 65% церамида или сфингомиелина, что было показано методом ТСХ.

Статистическую обработку результатов производили с использованием пакета статистических программ «STATISTICA 6.0». Межгрупповые различия оценивали с использованием критерия МаннаУитни. Проверка достоверности различий показателей в группе на разных этапах исследований проводилась с применением критерия парных сравнений Вилкоксона.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В эксперименте на крысах нами была исследована роль компонентов сфингомиелинового цикла в развитии экспериментального рака печени, индуцированного N–диэтилнитрозамином. Наблюдение проводили в ходе курсового введения компонентов сфингомиелинового цикла (сфингомиелина или церамида) в составе липосом.

Формирование гепатоцеллюлярного рака у крыс наблюдалось к концу четвертой недели после начала его индукции. При этом было установлено повышение активности каталазы в печени экспериментальных животных на второй и четвертой неделях гепатоканцерогенеза в 2,9 и 3,2 раза, соответственно (p <0,05) (рис.

1). Показано, что высокая активность каталазы способствует резистентности клеток к апоптозу [Bai J., Cederbaum A.I., 2003], что и было нами продемонстрировано (рис.2).

При повышении активности каталазы должно происходить снижение количества перекиси водорода, в том числе и перекисей липидов. Однако содержание ТБК–активных продуктов в печени животных на второй и четвертой неделях развития гепатоцеллюлярного рака было повышенным (в 2,4 раза, p <0,05) (рис. 3).

Однонаправленные изменения активности каталазы и содержании ТБК–активных продуктов в печени крыс (их повышение) в указанные сроки исследования могут быть обусловлены тем, что при развитии рака печени, индуцированного N–диэтилнитрозамином, наряду с увеличением количества перекиси водорода происходит повышение содержания и других активных форм кислорода, стимулирующих процессы ПОЛ [Мельников О.Р., Момот В.Я., Пятчанина Т.В., 2000].

Соответственно, интенсивность процессов липопероксидации на данном этапе может определяться функциональной активностью других ферментов антирадикальной защиты, исследование которых нами не проводилось.

Более выраженная активация каталазы в печени крыс (рис. 1) на пятой и восьмой неделях гепатоканцерогенеза сопровождалась нормализацией содержания ТБК–активных продуктов (рис. 3) к пятой неделе исследований с последующим снижением их количества (на 19%) к двенадцатой неделе эксперимента. Снижение количества ТБК–активных продуктов к двенадцатой неделе индукции рака может быть обусловлено уменьшением количества ненасыщенных жирных кислот, являющихся субстратом для процессов ПОЛ, в динамике гепатоканцерогенеза.

Известно, что перекисный механизм повреждения липидов тесно связан с действием фосфолипаз. Окисленные фосфолипиды легче подвергаются гидролизу фосфолипазами, а они, в свою очередь, делают липиды более доступными для свободнорадикального окисления [Дудник Л.Б., 2000].

Активность фосфолипазы D в ходе развития гепатоцеллюлярного рака увеличивалась (рис. 4), превышая показатели контрольной группы животных к двенадцатой неделе наблюдений в 3,4 раза (p < 0,05). При гидролизе фосфатидилхолина фосфолипазой D образуется фосфатидная кислота, которая участвует передаче сигнала через каскад MAPкиназ и способствует опухолевой прогрессии [Foster D, 2003].

Однако лизофосфатидная кислота, которая образуется из фосфатидной под действием фосфолипазы А2 оказывает более выраженное стимулирующее влияние на интенсивность процессов малигнизации по сравнению со своим предшественником [Грибанов Г.А., 1991; Eder A., Sasagawa T., Mao M. et al., 2000]. В динамике гепатоканцерогенеза наблюдалось стабильное увеличение активности фосфолипазы А в печени животных (рис. 5) с превышением данного показателя у крыс контрольной группы к двенадцатой неделе эксперимента в 2 раза (p < 0,05).

Активация фосфолипаз и перекисного окисления может явиться существенным моментом в изменении содержания липидов. В нашем исследовании показано, что содержание сфингомиелина в первые четыре недели индукции гепатоканцерогенеза не отличалось от показателей контрольной группы (рис. 6). В дальнейшем наблюдалось увеличение количества сфингомиелина в печени крыс данной группы с пятой по двенадцатую недели с превышением показателей группы контроля в 1,3 – 1,5 раза (p < 0,05).

Содержание церамида в печени животных в динамике канцерогенеза было сниженным (рис. 7). Следует отметить, что, начиная с пятой недели наблюдений снижение количества данного компонента цикла сфингомиелина было менее выраженным по сравнению с предыдущими сроками исследований, и к двенадцатой неделе содержание церамида достигало уровня контрольной группы животных. При этом содержание сфингозина (рис. 8) в динамике канцерогенеза изменялось неоднозначно:

повышалось на второй и четвертой неделях гепатоканцерогенеза (в 1,5 и 1,2 раза, соответственно, p < 0,05) и снижалось к восьмой и двенадцатой неделям наблюдений (в 1,2 и 1,3 раза, p < 0,05).

В следующей части работы проведено исследование влияния сфингомиелина и церамида, введенных в составе липосом, на развитие экспериментального гепатоцеллюлярного рака. Введение «пустых» липосом на фоне индукции рака печени не приводило к значимым изменениям морфологической картины печени крыс, содержания компонентов сфингомиелинового цикла (рис. 9, 10, 11), ТБК–активных продуктов (рис. 14), активности каталазы (рис. 12), фосфолипаз А2 и D (рис. 15, 16) и интенсивности процесса апоптоза (рис. 13). Следовательно, можно исключить непосредственное участие фосфатидилхолина, составляющего структуру липосом, в реализации эффектов сфингомиелина или церамида, введенных на фоне индукции гепатоканцерогенеза у крыс.

Воздействие на раковый процесс путем курсового введения липосом, нагруженных сфингомиелином приводило, по данным морфологического анализа ткани печени, к смещению во времени (до пятой недели наблюдений) этапа формирования раковых очагов. Церамид способствовал более выраженному, по сравнению со сфингомиелином, снижению интенсивности процесса малигнизации в печени.

Введение липосом, нагруженных компонентами сфингомиелинового цикла, на фоне развития гепатоклеточной карциномы приводило к увеличению содержания сфингомиелина и церамида в печени экспериментальных животных (рис. 9, 10).

Церамид обладает антипролиферативным действием, а также является индуктором апоптоза [Hannun Y.A.. 1996; Nilsson A., 2006; Taha T., 2004]. Однако при введении липосом, нагруженных сфингомиелином, в динамике гепатоканцерогенеза этап формирования морфологических признаков гепатоцеллюлярной карциномы всего лишь сдвигался во времени. Следовательно, увеличение периода хронического воспаления, предшествующего появлению признаков гепатоцеллюлярного рака, может быть обусловлено повышенным содержанием сфингозина на второй и четвертой неделях гепатоканцерогенеза в период введения липосом (рис. 11). Это связано с тем, что сфингозин, как и церамид, способен оказывать стимулирующее влияние на процесс апоптоза, однако действует в меньших концентрациях [Алесенко А.В., 1998].

В дальнейшем, содержание сфингозина у крыс, которым вводили сфингомиелин в составе липосом, снижалось, составляя к двенадцатой неделе наблюдений 73% от показателей группы контроля.

Рис. 9. Содержание сфингомиелина (в % от показателей контрольной группы) в печени крыс при введении не нагруженных («пустых») липосом, липосом содержащих сфингомиелин или церамид на фоне развития гепатоцеллюлярной карциномы Примечание: a p<0,05 (достоверность различий по отношению к контрольной группе);

b p<0,05 (достоверность различий по отношению к группе с развитием гепатоцеллюлярной карциномы); c p<0,05 (достоверность различий в группе на данном этапе исследований по отношению к предшествующему); d p<0, (достоверность различий по отношению к группе с введением «пустых» липосом на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы); f p<0,01 (достоверность различий по отношению к группе с введением на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы липосом, нагруженных сфингомиелином).

Рис. 10. Содержание церамида (в % от показателей контрольной группы) в печени крыс при введении не нагруженных («пустых») липосом, липосом содержащих сфингомиелин или церамид на фоне развития гепатоцеллюлярной карциномы Примечание: a p<0,05 (достоверность различий по отношению к контрольной группе); b p<0,05 (достоверность различий по отношению к группе с развитием гепатоцеллюлярной карциномы); c p<0,05 (достоверность различий в группе на данном этапе исследований по отношению к предшествующему); d p<0, (достоверность различий по отношению к группе с введением «пустых» липосом на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы); f p<0,01 (достоверность различий по отношению к группе с введением на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы липосом, нагруженных сфингомиелином).

Рис. 11. Содержание сфингозина (в % от показателей контрольной группы) в печени крыс при введении не нагруженных («пустых») липосом, липосом содержащих сфингомиелин или церамид на фоне развития гепатоцеллюлярной карциномы Примечание: a p<0,05 (достоверность различий по отношению к контрольной группе); b p<0,05 (достоверность различий по отношению к группе с развитием гепатоцеллюлярной карциномы); c p<0,05 (достоверность различий в группе на данном этапе исследований по отношению к предшествующему); d p<0, (достоверность различий по отношению к группе с введением «пустых» липосом на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы); f p<0,01 (достоверность различий по отношению к группе с введением на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы липосом, нагруженных сфингомиелином).

Pages:     | 1 || 3 | 4 |




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.